细胞划痕实验

因业务调整，部分个人测试暂不接受委托，望见谅。

细胞划痕实验步骤

　　1、划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5～1cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线;

　　2、铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于 6 孔培养板;细胞铺板 6w/孔，接种原则为过夜后融合率达到 100%，每孔最终的培养基总量 2mL;

　　3、细胞培养 37℃、5%CO2 培养箱中培养 24h;

　　4、划痕：第二天用 200 微升枪头比着 6 孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜;

　　5、清洗：PBS 冲洗细胞 3 次，除去划下的细胞，加入无血清培养基;

　　6、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 横线划痕。4 倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按 0,6,12,24h 时间点取样，拍照。

　　7、结果分析，使用 ImageJ 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。

　　8、数据处理：

　　细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始划痕面积-t 时刻划痕面积)/初始划痕面积细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始细胞间距离均值-t 时刻细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值

细胞划痕实验注意事项

　　1、划线的目的只是为了辅助划痕时划的更直，有利于后续拍照分析，划线会在拍照前擦去。

　　2、细胞接种数量需根据细胞生长速度和状态而定，接种原则为过夜后融合率达到 100%，即细胞间没有空隙，否则会影响后续拍照分析。

　　3、同浓度不同孔之间划痕最好使用同一只枪头，减少划痕距离的误差。划痕时枪头垂直，不能倾斜，可比着直尺或孔板盖，保持力度一致，一次性划完。

　　4、冲洗时要温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片。

　　5、降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：①使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响;②一般认为 24h 为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6,12,24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;③如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理 1h，抑制细胞的分裂。

　　6、尽量保证各个划痕宽度一致，人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷，有条件的同学可以选择 culture Insert(如下图)，将细胞接种于 Dish 中间的 Insert，培养。细胞长满 Insert 区域后用镊子移除 Insert 即可产生 500um、1000um 宽度的划痕。

　　7、不是所有的细胞都适合划痕实验，一些细胞呈团簇状生长，悬浮细胞更不能进行划痕实验。

　　工程师会根据不同产品类型的特点、不同行业和不同国家的法规标准以及客户的需求，选取相应的检测项目和方法进行细胞划痕实验。

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