Real time PCR实验

因业务调整，部分个人测试暂不接受委托，望见谅。

一、Real time PCR实验 注意事项：

　　1. 实验材料的处理和准备

　　在第一讲 RNA 抽提中已经讲过一些，还需要注意的是， 以最基本的基因表达差异分析为例，实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。组内要有复孔，要有生物重复，这样可以统计分析此处理是否有统计学意义。

　　2. 引物设计

　　一般Real-Time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：

　　扩增产物长度在 80-150bp。

　　引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

　　产物不能形成二级结构。

　　产物长度一般在 15-30 碱基之间。

　　G+C 含量在 40%-60%之间。

　　碱基要随机分布。

　　引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。

　　引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。

　　引物 5’端可以修饰。

　　引物 3’端不可修饰。

　　引物 3’端要避开密码子的第 3 位.

　　Taqman 探针的设计稍有不同，遵循以下原则：

　　尽量靠在上游引物;

　　长度 30-45bp，Tm 比引物高至少 5℃;

　　5’端不要是 G，G 会有淬灭作用，影响定

　　3. 常用的相对定量数据分析方法有：

　　双标曲线法、ΔCt 法、2‐ΔΔCt法(Livak法 )、用参照基因的ΔCt 法。

　　双标曲线法：每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线， 并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后使用如下公式得出目的基因表达差异。

　　ΔCt 法：不用内参基因作为标准， 实验设计简单，数据分析处理简单。 需要准确量化初始材料(如细胞数目或核酸微克数)，扩增效率为 100%。计算公式如下：

　　2‐ΔCt=2‐(实验组 Ct‐对照组 Ct)

　　2‐ΔΔCt法：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近 100%，且相对偏差不超过 5%。计算公式如下：

　　首先用内参基因的 Ct 值对实验组(test)和对照组 (con)的靶基因 Ct 值进行归一化：

　　ΔCt test=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

　　ΔCt con=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

　　随后用对照组的Ct值归一实验组的ΔCt：

　　ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

　　最后计算表达水平的差异倍数：

　　Change Fold=2‐ΔΔCt

　　用参照基因的ΔCt 法：这个方法的使用前提与2‐ΔΔCt法相同。计算方法如下：

　　对照组表达=2(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)

　　实验组表达=2(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)

　　这种方法得到的对照组表达水平不是 1.0，但如果将得到的两个表达值都除以对照组表达值，则得到：

　　对照组 Ratio=1

　　实验组 Ratio

　　=2(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)/ 2(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)

　　=2‐[(实验组目的基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)‐ (对照组目的基因 Ct‐对照组内参基因 Ct)]

　　=2‐(ΔCt test‐ΔCt con)

　　=2‐ΔΔCt

　　得到的比值与2‐ΔΔCt法是相同的，因此用参照基因的ΔCt 法是2‐ΔΔCt的一种变化形式。

PCR、western blot、ELISA的取舍?

　　PCR：检测的是mRNA，在一些特定情况下mRNA变化不等同于蛋白变化，如蛋白降解等。此外，某些mRNA是一定可以翻译成蛋白的，如miRNA、lncRNA、circRNA等，这种情况只能选择PCR检测RNA。此外，一些通路蛋白，如p65、β-catenin等，有较多转录后修饰方式，如磷酸化，这种发生于蛋白层面的变化PCR也是无能为力的。

　　推荐应用：临床组织、动物组织标本的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA检测。

　　western blot：检测蛋白表达或转录后修饰(磷酸化、剪切体、甲基化、苏素化、泛素化、乙酰化、多聚体、降解等)，与其他实验技术结合可以达到多种目的。应用最为广泛。细胞和组织都可以应用，也可以通过提取不同亚细胞组成用于检测蛋白的定位情况。为半定量实验。

　　推荐应用：细胞或组织中通路蛋白、一般蛋白的表达或转录后修饰。

　　ELISA：为定量实验，主要用于分泌型蛋白的检测居多。也可以用于动物血清、组织、细胞上清的蛋白检测。但是不适用于蛋白转录后修饰的检测，不推荐通路相关蛋白的检测。

　　推荐应用：细胞上清、组织、动物血清中分泌型蛋白，如细胞因子的检测。

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